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貝類5羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒操作流程

更新時間:2025-07-18      點擊次數(shù):107

     在完成標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的加樣后,需立即覆蓋封板膜,輕輕震蕩混勻30秒,確保反應(yīng)液充分接觸孔內(nèi)包被的抗體。隨后將酶標(biāo)板置于37℃恒溫孵育箱中,避光孵育60分鐘。此步驟的關(guān)鍵在于溫度與時間的精準(zhǔn)控制,避免因環(huán)境波動導(dǎo)致非特異性結(jié)合。

孵育結(jié)束后,小心揭開封板膜,甩盡孔內(nèi)液體,每孔加入350μL預(yù)冷的洗滌緩沖液(1×PBS),靜置30秒后棄去。重復(fù)洗滌4次,最后一次需在吸水紙上拍干,確保無殘留液體。注意動作輕柔,避免交叉污染或孔壁劃傷。

   接下來,每孔依次加入50μL辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗工作液,再次覆蓋封板膜,37℃孵育30分鐘。此階段需避光操作,防止酶活性衰減。二抗孵育完成后,重復(fù)上述洗滌步驟5次,去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

顯色反應(yīng)是檢測的核心環(huán)節(jié)。每孔加入現(xiàn)配的TMB底物溶液100μL,室溫避光孵育15-20分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色梯度變化時,立即加入50μL終止液(2M硫酸),溶液轉(zhuǎn)為黃色后,于450nm波長下測定各孔OD值。若使用雙波長校正,需同步讀取630nm參比數(shù)據(jù)以減少干擾。

   最后,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo),繪制四參數(shù)邏輯曲線(4PL)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣本中5-HT含量。若樣本OD值超出線性范圍,建議用稀釋液調(diào)整后復(fù)測。整個流程需在6小時內(nèi)完成,以保證試劑穩(wěn)定性。實驗結(jié)束后,妥善處理廢棄酶標(biāo)板及液體,避免生物污染。

注意事項:

1. 所有試劑使用前需平衡至室溫,避免反復(fù)凍融;

2. 加樣時槍頭避免觸碰孔壁,防止交叉污染;

3. 顯色時間過長可能導(dǎo)致背景偏高,需嚴(yán)格控制反應(yīng)時長。


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